设备检测方案书

色谱是一种分离科学，HPLC象其他类的色谱一样，依据样品的结构进行分离，HPLC分很多种，它们往往可以将物质分离，被分离的组分峰应该被检测到，通常最常用的检测器为UV/VIS或荧光检测器，但是很多物质不能够被检测，或者很难与背景区分以致不能被检测。柱后衍生则很好地解决了这一问题。 
    柱后衍生也称为柱后反应，主要目的是使本来不可检测的物质变为可检测的物质，这种方法主要是将分离后的物质通过反应使之具有可检测的物理性质。典型的方法是通过一种反应使物质带有带色基团，或使物质能够产生荧光。在有些情况下可以使检测灵敏度提高几个数量级。大部分的溶剂对于某一特定类型的物质有一定的选择性，该类物质因而可以从复杂的背景中被检测到。所以柱后衍生的作用在于提高灵敏度和选择性。 
  柱后衍生系统是将HPLC的柱后洗提液与衍生试剂混合，混合溶液在一定的时间内通过反应器完成反应，如果反应速度慢，将加热反应器以提高反应速度。有些反应则需要加入两种溶剂，最后混合液进入检测器检测一般是用UV/VIS或荧光检测。一个完善的柱后衍生系统需要计量泵、脉冲阻尼器、加热线圈、安全系统等以确保提供安全、可靠的数据。

柱后衍生系统和方法为您提供的可选择性、灵敏性和色谱重现性是UV-VIS 或柱前衍生方法所不能及的。柱后衍生仪可以与一套标准的液相色谱相连，配备衍生试剂和柱后设备为您提供一套可靠、的分离与检测方法。能为下列各种物质的分离与检测提供从仪器、试剂到分析方法的全套解决方案。

一、氨基酸

二、氨基甲酸酯

三、草甘膦

氨基酸 

介绍

柱后衍生技术可以改善灵敏度，提高选择性(减少干扰)，降低检测限。柱后衍生使用离子交换钠柱来测定蛋白质水解产物中的氨基酸，使用离子交换锂柱检测天然产物中的氨基酸。氨基酸柱后衍生的检测有两种手段。可以使用茚三酮试剂，来检测一级和二级氨基酸，或者使用邻苯二甲醛(OPA)，荧光检测，检测灵敏度更高，但只能分析一级氨基酸。

完全的柱后衍生系统包括如下部件：

HPLC 梯度泵

 带高pH 相容性的Tefzel 或者PEEK 密封的手动进样器或者自动进样器

 离子交换柱  柱后衍生仪器

洗提液，试剂和标准物可见或荧光检测器

图谱记录，积分和数据系统

背景

分离包括多种机制：离子交换、离子排阻、分配。主要过程为阳离子交换，pH 梯度将氨基酸调整至等电点。酸性氨基酸例如：谷氨酸，出峰时间早；碱性氨基酸例如：赖氨酸，出峰时间晚。分配机制受离子强度与有机修饰剂的影响。例如：苏氨酸和丝氨酸的分离依靠分配基质。离子排阻作用发生在强酸性氨基酸，例如：牛磺酸。

使用阳离子交换色谱柱可以快速分析水解蛋白质或者组成简单产品中的22 种氨基酸。锂离子交换柱分析时间长、但可以得到更高的分离度，可以分离复杂生物体液和组织提取物中的46 种氨基酸和化合物。

柱后衍生最常用的检测试剂为茚三酮。茚三酮与一级氨基酸反应，生成的还原茚三酮形成Ruhemann’s 紫色的荧光（如下图）,可在570nm 被检测出。茚三酮与二级氨基酸反应生成黄色复合物，可在440nm 出被检测。茚三酮的反应可在130℃，容量为500μL 的反应器中进行。需要提高反应温度，因为在常温下茚三酮的反应很慢。

基本样品制备

生理液体和蛋白质水解样品的一般制备过程。许多中样品会需要做氨基酸分析。

血浆、尿液、其它生理体液、植物提取物、食物和饮料中的天然氨基酸以“游离”状态存在，对这些样品的制备比水解氨基酸简单，省时。但是调节pH 和浓度，除去可溶氨基酸的过程会色谱图有很大影响。

早出峰的氨基酸－牛磺酸，尿素，苏氨酸，丝氨酸等－对pH 和浓度特别敏感，通常样品的pH 范围必须控制在2.1 和2.5 这一狭小的范围之间，和适当的锂离子浓度来保证重复性。后出峰物质对初始条件更耐受。SERAPREPTM 和URIPREPTM 替代常规使用的蛋白质沉淀剂，例如：乙晴、高氯酸、苦味酸。不用透析、超滤、多重离心。

 所有样品均用0.45μm 过滤膜过滤，有些样品则可能需要用更细的过滤膜，尤其存在胶体时。

  样品必须缓冲，进样的理想pH 范围为2.2±0.2。

 对于天然样品，分析前将所有的蛋白质去掉。

生理体液样品

使用制备SERAPREP 和URIPREP

使用SERAPREP提供高缓冲容量，制备血浆和其它样品。例如：沙丁鱼油。使用URIPREP

提供低缓冲容量制备尿液和其它样品，例如：果汁，瘤。蛋白质沉淀的效率和离心后pH 调整的需要决定了哪种更适合你的样品。

1. 在微离心管中完全混合等量的样品和SERAPREPTM 或者URIPREPTM

2. 静止5 分钟，将混合物以13000rpm 的转速离心5 分钟。

检查上清液pH 值确定pH 范围在2.3±0.2，根据需要调整最初混合比例。

3. 用注射过滤器（0.2 或者0.45μm）过滤上清液，过滤液可放入自动进样瓶进行氨基酸分析。

4. 如果需要进一步稀释，使用Li 220 调整分析物浓度。

试剂准备

1 将945mL OPA 稀释剂（Cat No OD104）倒入试剂瓶，留5mL 第五步使用。

2 盖上瓶盖，打开进气阀，开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟

3 将300mgOPA（Cat NO O120）溶解于10mL 色谱柱甲醇中。

4 关闭气源，打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。用1-2mL 的甲醇冲洗残留在瓶中的混合物。

5 溶解2g ThiofluorTM（Cat NO 3700-2000）与步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。

6 加入3mL 35%的Brij-35 溶液

7 盖上瓶盖，打开气源，使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。

注意：OPA 试剂对氧敏感，并逐渐降解。Pinnacle PCX 系统减慢它的氧化，OPA 试剂子在惰性气体的压力

下，一周内活性不会明显降低。

柱后衍生条件

这里推荐最常使用的氨基酸分析的柱后条件。HPLC 的条件，参看各段的开头样品色谱与梯度程序。

使用OPA 试剂

试剂1：邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释液中，再加35%Brij-35?

泵1 流速：0.30ml/min

反应器1 体积：500μL

反应器温度：45℃

使用次氯酸钠，然后再用OPA 试剂

试剂1：次氯酸钠于GA116 稀释剂中

试剂2：邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释剂，加35%Brij-35?。

泵1 流速：0.30ml/min 泵2 流速：0.30ml/min

反应器1 体积：500μL 反应器2 体积：100μL

反应器1 温度：45℃ 反应器2 温度：室温

过程

根据色谱柱类型和样品的不同， 推荐6 种不同的梯度条件。

柱温箱的控温程序为方法的优化提高了便利，使用温度梯度可以改善分离，缩短分离时间，调整检测方法。为了保护色谱柱将HPLC 的压力设置为220bar，在初始条件下平衡30 分钟。进10μL 氨基酸标样，至少收集三张谱图。张谱图放弃不用，使用后两张评估系统。