氨基甲酸酯TW-PCD2000柱后衍生设备检测方案书

介绍

农残检测方法主要有液相色谱法、光谱法、气质联用等，其中柱后衍生的高效液相法方法简单、可靠、灵敏度高。泰特仪器衍生系统引进国外先进的温度控制技术和关键的控制元器件，各项性能均能达到国外同类型仪器的指标，完全可以满足农业部相关标准的要求。且性能价格比远优于进口产品。

柱后衍生原理

背景

氨基甲酸酯类农药由于高效、经济而被广泛应用于蔬菜水果种植过程，但会对生态环境造成严重污染，并引发中毒。2004 年发布的我国农业标准NY/T 761 中，柱分离后在线水解生成的甲胺进行荧光衍生的检测方法作为蔬菜和水果中氨基甲酸酯类农药多残留检测方法被采纳。

N-氨基甲酸酯类化合物经反相色谱法分离，柱后在碱的条件下水分解生成甲胺。生成的甲胺与一级胺的荧光衍生化试剂O-苯二甲醛（OPA）反应，进行较高灵敏度的荧光检测。

氨基甲酸酯的一般结构是N-甲基取代氨基甲酸酯，有不同的成酯基团。结构分子式如图

图中的10 种氨基甲酸酯的分离可用  5μm C18 柱温恒定、以水/甲醇梯度洗脱。其出峰顺序根据其相对的疏水性。氨基甲酸酯（methiocarb）疏水性最强，最后被洗脱出来。

分析过程：氨基甲酸酯首先被NaOH溶液在100℃水解形成醇、碳酸盐、和甲胺。第二次反应中甲胺与邻苯二甲醛（OPA）和亲和试剂ThiofluorTM试剂反应形成一种高荧光的衍生物。

注意：1-萘酚不需要衍生也有荧光，胺甲萘水解后衍生也生成1-萘酚，但是两者具有不同的保留时间。这一特点可被用于故障诊断。

基本样品制备

下面是对蔬菜和水样品的制备。更多的细节请参看EPA531.2 对饮用水的检测，AOAC 对蔬菜的检测。

对蔬菜样品的检测

用已睛提取氨基甲酸酯，用甲醇重新溶解，用0.45μm 滤膜过滤

对水样品的检测

采样标准

EPA 采用标准

1 加1.8mL ClorAC 缓冲液到60mL 样品瓶（井水和河水见注释）

2 如果样品被氯化，每60ml 样品加入5mg 硫代硫酸钠。

3 将去氯化的样品加入到样品瓶中，密封并混匀。

4 10℃储存，4℃下运输可保存28 天。

样品制备

用0.45μm 滤膜过滤2mL 样品

进样量200-400μL

对标准品和空白：

将10mL ChorAC 用色谱纯水稀释至1000mL

注释：井水和河水中含有胶状铁离子。如果样品未过滤便储存，那么铁离子只有在反应器遇到NaOH 时才又沉淀出来。所以推荐先用0.45μm 滤膜过滤后再用ChlorAC 溶液保存。

试剂制备

氨基甲酸酯的分析需要两中衍生试剂：水解试剂（NaOH）和邻苯二醛

注意：使用前必须对试剂瓶、管线和泵进行清洗，再用甲醇冲洗，以较少荧光背景。

试剂1，水解试剂

关掉气源

清洗试剂瓶并用甲醇冲洗，用蘸过甲醇的干净纸巾擦拭吸取管。

水解试剂不需要制备。直接将水解试剂（Cat No CB130）倒入试剂瓶中。盖上瓶盖，关闭进气阀。

水解试剂会一直很温度

注意： 不推荐自己配制水解试剂，因为高纯度的NaOH 很达到。

试剂2：OPA 试剂

1 将945mL OPA 稀释剂（Cat No CB910）倒入试剂瓶，留5mL 第五步使用。

2 盖上瓶盖，打开进气阀，开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟

3 将100mgOPA（Cat NO O120）溶解于10mL 色谱纯甲醇中。

4 关闭气源，打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。

5 溶解2g ThiofluorTM（Cat NO 3700-2000）与步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。

6 盖上瓶盖，打开气源，使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。

注意：不推荐自行配制OPA 稀释液，因为硅酸钠包含许多重金属离子和不溶物质。它们将会沉淀在反应器和流通池中。一年的质保不包括此种污染带来的损坏。

OPA 试剂对氧敏感并会降解。当OPA 试剂瓶中充满惰性气体时，OPA 试剂的活性和保持2 周。

柱后分析条件

屏幕显示：4位LED实际温度显示(红色)  4位LED设定温度显示(绿色

氨基甲酸酯分析推荐的柱后衍生条件，相关的HPLC条件参见样品谱图与梯度洗脱部分。

试剂1：CB130,水解试剂（NaOH）

试剂2：邻苯二醛和ThiofluorTM 于CB190 稀释液中

泵1：流速：0.30ml/min

泵2：流速：0.30ml/min

反应器1：500μL100℃

反应器2：100μL 室温

分析过程

在最初条件下让色谱柱平衡约20 分钟

注射10μL 氨基甲酸酯测试混合液（或者一定体积的自制标准品），收集张谱图。

样品谱图与梯度洗脱

以下峰名应用与本节的所有谱图

1 涕灭威亚砜                      7 残杀威

2 涕灭威砜                        8 卡巴呋喃

3 草氨酰                          9 胺甲萘

4 甲氨叉威                        10 1-萘酚

5 3-羟基卡巴呋喃                   11 氨基甲酸酯

6 涕灭威                          12 BDMC 内标物

氨基甲酸测试混合物，10μL 进样，25cm，C8 柱（0840250）

氨基甲酸测试混合物，0.25ppb，10μL 进样，25cm，C8 柱（0840250）

0840250 柱（4.0mm ID×250MM）用于甲醇溶解样品

HPLC 流速：0.8ml/min 柱温37℃

氨基甲酸测试混合物，10μL 进样，15cm，C18 柱（1846150）

1846150 柱（4.6mm ID×150MM）用于甲醇溶解样品

HPLC 流速：1ml/min 柱温42℃

氨基甲酸测试混合物，10μL 进样，25cm，C18 柱（1846250）

1846250 柱，（4.6mm ID×250MM）用于甲醇溶解样品

HPLC 流速：1ml/min 柱温42℃

完成分析之后，执行关闭程序，将氨基甲酸酯分析柱保存于100％甲醇中。

注意：保存OPA 试剂是应保留惰性气体，关闭试剂瓶上蓝色的试剂阀防止不使用时试剂虹吸。

氨基甲酸酯分析的注意事项

1.配制试剂过程中要始终配带手套，OPA 与ThiofluorTM 试剂会引起皮肤刺激。OPA 试剂为对氧敏感，不断降解。得到的灵敏度需新制溶液。在惰性气体的保护下，OPA 试剂可以保存两周。ThiofluorTM 具有强烈的吸湿性，一定要在密封性好的容器中保存。

2.不推荐用户自制OPA 稀释剂，因为硼酸钠（任何等级）包含着大量的重金属离子污染物?筒蝗芪镏省Ｕ庑┎淮课锘岢恋碓诜从ζ骱土魍ǔ刂小Ｓ纱嗽斐傻乃鸹挡辉诒Ｐ薹段е小?/span>

3.使用色谱级的甲醇和水，防止产生基线漂移、鬼峰和基线噪音。

4.推荐使用瓶装的色谱级纯水，特别是在系统刚开启时。如果使用水净化系统得到的水，要确保此水净化系统经过了活性碳清除了有机物，并且活性碳柱芯必须安装在离子交换柱芯的后面。（许多离子交换树脂没有去除对OPA 有影响的污染物而产生不可接受的荧光背景。）

5.试剂瓶中的液体必须每隔3 到4 天更换一次以防止细菌的生长。

6.测试混合物只能作为氨基甲酸酯的定性测定，不推荐将其作为校正使用。

7.所有样品必须通过0.45μm 薄膜过滤。如果存在胶体，则需进一步过滤。

8.水性样品溶解于适合的缓冲溶液，具体细节参见EPA 531.2.

9.甲醇溶解样品，进样10μl。近样量大降引起峰的变形。

10.小体积水样进样（<20μl），两种分析柱均可以使用。当进样体积大于300μl，则只能使用25cm 的分析柱，并使样品停留在泵头一段时间。

11.不要使用100％乙晴灌冲系统，因为其可能会使反应器中产生硅盐沉淀。如果使用乙晴作为流动相，乙晴的浓度不要超过70％。

12.不要用水保存色谱柱。

参考文献

[1]NY/T 761-2008 蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定

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