氨基酸TW-PCD2000柱后衍生设备检测方案书

介绍

柱后衍生技术可以改善灵敏度，提高选择性(减少干扰)，降低检测限。泰特仪器柱后衍生使用离子交换钠柱来测定蛋白质水解产物中的氨基酸，使用离子交换锂柱检测天然产物中的氨基酸。氨基酸柱后衍生的检测有两种手段。可以使用茚三酮试剂，来检测一级和二级氨基酸，或者使用邻苯二甲醛(OPA)，荧光检测，检测灵敏度更高，但只能分析一级氨基酸。

完全的柱后衍生系统包括如下部件：

1.HPLC 梯度泵

2.带高pH 相容性的Tefzel 或者PEEK 密封的手动进样器或者自动进样器

3.离子交换柱

4.柱后衍生仪器TW-PCD2000

5.洗提液，试剂和标准物

6.可见或荧光检测器

7.图谱记录，积分和数据系统

背景

分离包括多种机制：离子交换、离子排阻、分配。主要过程为阳离子交换，pH 梯度将氨基酸调整至等电点。酸性氨基酸例如：谷氨酸，出峰时间早；碱性氨基酸例如：赖氨酸，出峰时间晚。分配机制受离子强度与有机修饰剂的影响。例如：苏氨酸和丝氨酸的分离依靠分配基质。离子排阻作用发生在强酸性氨基酸，例如：牛磺酸。

使用阳离子交换色谱柱可以快速分析水解蛋白质或者组成简单产品中的22 种氨基酸。锂离子交换柱分析时间长、但可以得到更高的分离度，可以分离复杂生物体液和组织提取物中的46 种氨基酸和化合物。

柱后衍生最常用的检测试剂为茚三酮。茚三酮与一级氨基酸反应，生成的还原茚三酮形成Ruhemann’s 紫色的荧光（如下图）,可在570nm 被检测出。茚三酮与二级氨基酸反应生成黄色复合物，可在440nm 出被检测。茚三酮的反应可在130℃，容量为500μL 的反应器中进行。需要提高反应温度，因为在常温下茚三酮的反应很慢。