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酵母双杂交技术的基本知识

发布日期：2022-04-03

酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的一种技术手段，自Fields和 Song于 1989年建立以来，至今已得到了广泛的运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用于研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物、微生物基因组编码的蛋白质之间的互作，还可以用来研究病原微生物与宿主之间的蛋白质相互作用。因此，它在许多的研究领域中有着越来越重要的广泛应用。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子（例如酵母转录因子GAL4）通常是由两个或两个以上在结构上可以分开、在功能上相互独立的结构域（domain）构成的。其中能结合DNA的那部分称为DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)，而能与RNA聚合酶结合的那部分称为转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。即使将这两个结构域它们分开时，它们仍分别具有各自的功能。例如，DNA-BD仍然能与特定的DNA结合，而DNA-AD仍然能与RNA多聚酶结合，但是却不能激活基因的转录。只有当被分开的这两者通过适当的途径在空间上能够足够接近时，才能重新表现出完整的转录因子活性（例如GAL4），并可激活启动子下游的基因转录表达。

根据这个原理，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质的基因共同构建在一个表达载体上，使它能在酵母中表达两者的融合蛋白——BD-诱饵蛋白（Bait protein）。同时，将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-文库表达载体上。如果将上述两种载体共转化进入一个特定的酵母细胞（这种酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，也不能合成亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长），当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的转录因子就能够结合到酵母基因组中一些特定报告基因（例如HIS3、ADE2、URA3、LacZ等）的启动子区并激活这些报告基因的转录表达，从而通过功能互补而使酵母细胞能在特定的选择培养基上生长，或通过显色反应而筛选到阳性菌落。将阳性酵母菌落中的AD-文库质粒提取分离出来，再经过对文库载体中插入的基因进行测序和分析就可以知道从文库中筛选到的是什么蛋白的编码基因。