一、植物组织蛋白质提取方法

　　1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。

　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。

　　3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

　　4、提取上清液，样品制备完成。

　　蛋白质提取液：300ml

　　1、1Mtris-HCl(PH8)45ml

　　2、甘油(Glycerol)75ml

　　3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

　　这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

　　二、植物组织蛋白质提取方法

　　氯醋酸—丙酮沉淀法

　　1、在液氮中研磨叶片

　　2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

　　3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。

　　4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

　　药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

　　这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

　　三、组织：肠黏膜

　　目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达

　　应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

　　含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

　　倒转混匀，置室温10min

　　离心：12000g，10min，4度，弃上清

　　加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)

　　振荡，置室温20min

　　离心：7500g，5min，4度，弃上清

　　重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

　　沉淀中加入100％乙醇2ml

　　充分振荡混匀，置室温20min

　　离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

　　1％SDS溶解沉淀

　　离心：10000g，10min，4度

　　取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)

　　存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

　　解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

　　四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根

　　1、200毫克样品置于冰上磨碎

　　2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

　　3、重复离心5min

　　lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40

　　五、蛋白质样品制备

　　秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。

　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，