利用CTAB法在多样品组织研磨机上提取植物总DNA

 

 

一、        实验试剂：

      1.CTAB抽提液：

2%（w/v）CTAB

100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

20 mmol/L EDTA(pH8.0)

1.4 mol/L NaCl

抽提含多酚较多的植物材料时（比如木本植物），上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入约2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。

2、醋酸钠：

3 mol/L NaAc

用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。

3、TE溶液：

4、其它：

无水乙醇，异丙醇，75％乙醇，酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），氯仿：异戊醇（24：1），β-巯基乙醇，重蒸水。

二、        实验步骤

1.      样品研磨

1)        取1g的样品放入2ml epp管中

2)        加入1-2粒5mm研磨珠

3)        加入1ml的CTAB 抽提液

4)        将加有样品的epp管放入多组织研磨仪的适配器中，盖好

5)        将研磨频率调到60Hz，设定研磨时间为90秒（可根椐样品的研磨的难易程度来调节，此数据是以银杏落叶为样本得出）

6)        启动研磨仪对样品进行研磨（根据不同的样品，本身性质不同，需要对研磨频率和研磨时间进行适当的调整）

2.      DNA的粗提

1)       将研磨好的样品取出于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀

2)       冷却后加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min

3)       7000g-8000g离心10min（18-20℃）

4)       吸取上清于另一干净的离心管中

5)       （根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次，吸取上清）

6)       加入与上清液等体积（且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，约1至2分钟后应有白色絮状沉淀出现（若没有，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc,混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min）

7)       离心法沉淀DNA

8)       在75%乙醇中漂洗DNA数分钟以上，用Tip头吸干乙醇

9)       用1ml 75%乙醇再漂洗一次

10)    沉淀于室温或64℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥

11)    用50μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。

3.      DNA的纯化

1)       向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μl RNaseA(约40-100μg)

2)       于37℃酶解RNA 1hr或65℃酶解RNA 30min以上

3)       加入50μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻颠倒混匀10min

4)       10000g以上常温离心10min，吸取上清

5)       加入50μl仿氯：异戊醇（24：1）轻轻颠倒10min

6)       10000g以上常温离心10min，吸取上清 (根据需要可重复用氯仿：异戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚)

7)       向上清中加入1/5-1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc,并加入2.5倍体积无水乙醇，于－20℃沉淀30min以上

8)       12000g、4℃低温离心10min,吸干液体

9)       沉淀用75％乙醇漂洗二次

10)    沉淀于室温或64℃以下恒温箱中干燥片刻至刚开始出现半透明状，勿过度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶

11)    取5μl DNA电泳检查DNA的质量

12)    100-500倍稀释后于分光光度计上测定OD260及OD280，分析DNA的浓度和质量

13)    保存DNA于-20℃

 

 

补充：如果需要提取的样品比较多（比如1g），研磨好的样品在后续的提取中，需要转移到大的epp管中，研磨时可以加入较少的抽提液，研磨完毕按照1g样品10ml提取液补充抽提液，进行后续的操作。